于定国字曼倩，东海郯县人。
他的父亲于公做过县狱史、郡决曹，审判狱讼案件公平，凡属于公审判的都不怨恨。
郡中为他立有生祠，号曰于公祠。
东海有一孝妇，很年轻就失去丈夫，又无儿子，可她侍养婆婆很周到。
婆婆想让她改嫁，她始终不肯。
婆婆对邻人说“：孝媳侍奉我很辛苦，可怜她无子守寡。
我老了，长久地拖累她，怎么办？”其后婆婆自己吊死了，姑子报告官吏：“寡妇杀害我母。”官吏拘捕孝妇，孝妇不承认杀害婆婆。
狱吏严刑拷问，孝妇只好含冤招认，据以定罪的全部案卷上报到府，于公认为此妇奉养婆婆十余年，以孝顺闻于乡里，一定不会杀害婆婆。
太守不听，于公争辩，不能胜，于是抱着定罪的全部案卷，哭于府堂上，因此推说有病辞了职。
太守竟判罪杀死了孝妇。
郡中枯旱三年。
后来的太守到任，占卜枯旱的原因，于公说：“孝妇不当死，前任太守硬判她死罪，灾害原因或许就在此吧？”于是太守杀牛亲自去祭祀孝妇冢，并刻石于其基，以表彰其孝道。
天立即降大雨，那年年成好。
郡中人因此格外敬重于公。
于定国幼时在父亲教育下学习法制条文，父死，于定国也做了狱史、郡决曹，补做廷尉史，被选拔参与御史中丞从事处理反叛者的狱讼，因为才高被推举为侍御史，又提升做了御史丞。
恰巧碰上汉昭帝崩，昌邑王被征召即位，行为淫乱，于定国上书劝阻。
后来昌邑王被废除，汉宣帝登基，大将军霍光领尚书事，凡是具文上奏劝阻立昌邑王的群臣都越级提拔。
于定国因此做了光禄大夫，治理尚书事，很受器重。
过了几年，调任水衡都尉，一跃做了廷尉。
于定国向老师请教学习《春秋》，亲自拿着经籍，备具弟子礼北面拜师。
为人谦恭，特别尊重懂经术的士，即使是卑贱徒步来访的，于定国都与之平等相待，感恩敬重十分周到，学士们无一不称赞他。
他解决疑案量法定刑时，力求同情鳏寡，定罪有疑问的从轻，加重审慎之心。
朝廷称赞他说：“张释之做廷尉，天下无冤民；于定国做廷尉，百姓没有怕受冤的顾虑。”于定国嗜酒多饮而清醒，冬月实施法制评议罪犯，喝了酒更加精细明察。
他做廷尉十八年后调任御史大夫。
甘露年中，代黄霸做丞相，被封为西平侯。
三年后，宣帝崩，元帝(刘..)即位，因于定国是任职旧臣，很敬重他，当时陈万年为御史大夫，与定国并位八年，论议无相违戾。
后来贡禹代为御史大夫，屡次与于定国持不同意见。
于定国精通政事，其主张皇上一般都认可。
然而元帝刚即位，关东连年遭受灾害，百姓流入关内，有人上疏归罪于大臣。
皇上于是几次于上朝之日引见丞相、御史，接受诏令，用职责之事逐条责问，皇上说：“坏官吏、盗贼出现了抓不到，怕遭受处罚，便胡乱怀疑好人，以至无罪处死。
有的盗贼发生，官吏不赶快追捕，反而抓丢失财物的人，后来都不敢报告遭难情况，因此盗贼渐广。
百姓多冤屈，州郡官吏不处理，不断地有上书给朝廷反映情况的。
郡守一级的官员选拔不真实，因此在位的县令丞尉多不称职。
民田有了灾害，官吏不肯减免租税，反而催收其租，所以百姓困难重重。
关东流亡的百姓饥寒疾疫交加，虽然已下诏令官吏运粮食，开仓放粮拯救百姓，赐寒者衣物，但到明春恐怕不够。
现在丞相、御史将打算采取什么措施来弥补这个过失？尽意逐条写下情况，陈述朕的过失。”于定国上书认罪。
永光元年(前43)，春季降霜，夏季天寒，日呈青色而无光芒，皇上又降诏逐条责问说：“有东方来的官员，说那里百姓遭受饥饿，父子不能相养。
是丞相、御史考察事情的官吏隐瞒不说呢？还是从东方来的人虚报呢？为什么所言不同至此呢？想要知道那里实情。
当今年成好坏未可预知，当前出现水灾旱灾，那个忧愁就不少。
你们有可以防止灾害于未然，拘挽灾害的办法没有？你们各人以实回答，不要有隐瞒。”于定国恐惧，上书自我弹劾，归还侯印，请求退职。
皇上回答说“：你辅佐我，不敢怠慢休息，万方之事，靠君总管，能够没有过错的，恐怕只有圣人。
当今我朝承袭周秦之弊端，民俗风化败坏，百姓少礼仪，大自然不协调，灾害的发生不是因为某一项原因而产生的，从圣人以来记载的，都不敢由某一人承担，何况不是圣人呢？日夜思考招致此灾的来由，也不能都清楚。
经典说‘万方有罪，罪在寡人’。
你虽任丞相职，何必一人承担呢？希望勉励督促郡守县令们，责难那些人，不要让他们长期残害百姓，永远秉持法纪，务必都要明智，注意身体健康。”于定国于是称老，一再推辞，皇上才赐四马驾的平安车，黄金六十斤，免去他的丞相职位让他回家。
过了几年，七十多岁去世，谥号为安侯。
于定国的儿子于永为继承人。
于永少时嗜酒，多过失，年纪将近三十，才克制自己修身实践，因父任职关系做过侍中中郎将、长水校尉。
于定国死后，居丧随礼，孝行闻于当朝。
因此以列侯身份做散骑光禄勋，直到御史大夫。
匹配馆陶公主刘施。
刘施是汉宣帝长女、汉成帝的姑姑，贤惠有德行，于永选配了她。
皇上正打算用他作丞相，恰巧这时于永去世。
于永的儿子于恬继承。
于恬不才，行为浅薄。
起初，于定国的父亲于公，他所处的闾里的门坏了，父老们共同修理它，于公对大家说：“稍微把闾门修得高大一些，使它能容驷马驾的高盖车。
我管理狱讼事广有阴德，不曾冤枉过人，子孙后代一定有发迹兴旺的。”后来于定国官至丞相，于永官至御史大夫，封侯传世。